Ο νέος αναστολέας PCNA AOH1996 δείχνει επιλεκτική θανάτωση καρκινικών κυττάρων και δυνατότητα καταστολής όγκου Μια πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο Cell Chemical Biology Journal περιέγραψε έναν αναστολέα μικρού μορίου του πολλαπλασιαζόμενου πυρηνικού αντιγόνου κυττάρων (PCNA) που σκοτώνει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα.
Η PCNA είναι μια διατηρημένη πρωτεΐνη πολλαπλών όψεων σε ευκαρυώτες με κρίσιμο ρόλο στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA και έχει χρησιμοποιηθεί ιστορικά ως δείκτης για την εξέλιξη του όγκου.
Το στρες αντιγραφής του DNA είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων που έχουν χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτική στρατηγική για την πρόκληση περαιτέρω βλάβης στο DNA που οδηγεί σε καταστροφικές συνέπειες για τα καρκινικά κύτταρα.
Έτσι, το PCNA αντιπροσωπεύει έναν κύριο αντικαρκινικό στόχο, δεδομένου του ρόλου του στην αντιγραφή/επιδιόρθωση του DNA. Επιπλέον, η ανακάλυψη μιας ξεχωριστής ισομορφής PCNA που σχετίζεται με τον καρκίνο (caPCNA) έχει ανοίξει νέους δρόμους για την ανάπτυξη νέων χημειοθεραπευτικών. Προηγουμένως, οι συγγραφείς περιέγραψαν έναν πιθανό αναστολέα (AOH1160) του caPCNA που δεν είχε κατάλληλες μεταβολικές ιδιότητες.
Η μελέτη και τα ευρήματα
Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές εντόπισαν και χαρακτήρισαν τα μοριακά χαρακτηριστικά του AOH1996, ενός αναλόγου του AOH1160. Μοντελοποίησαν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ PCNA και πιθανών προσδεμάτων για να σχεδιάσουν και να συνθέσουν περίπου 70 ανάλογα του AOH1160 τροποποιώντας τον συνδέτη γλυκίνης του μορίου, τον διφαινυλαιθέρα και μια ναφθυλική ομάδα.
Η ομάδα ναφθυλίου αντικαταστάθηκε με μονο- ή δικυκλικές αρωματικές ομάδες. ο συνδέτης γλυκίνης αντικαταστάθηκε με αφύσικα και φυσικά αμινοξέα. Αυτές οι τροποποιήσεις δεν προκάλεσαν βελτιώσεις στην ισχύ. Έτσι, ο διφαινυλαιθέρας διερευνήθηκε για τη σχέση δομής-δραστικότητας με διάφορους τρόπους που οδήγησαν στην ταυτοποίηση δύο αναλόγων, του AOH1160-1LE και του AOH1996.
Οι αναλύσεις θερμικής μετουσίωσης αυτών των ενώσεων έδειξαν σταθεροποιητικές αλληλεπιδράσεις με το PCNA. Οι ερευνητές δημιούργησαν κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο PCNA, με υποκατάσταση L47V, και αξιολόγησαν την ευαισθησία τους στο AOH1996. Όλα τα μεταλλαγμένα κύτταρα ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην αναστολή από το AOH1996 από τα κύτταρα άγριου τύπου και τα ομόζυγα μεταλλάγματα ήταν τα λιγότερο ευαίσθητα.
Στη συνέχεια, η ομάδα εξέτασε το AOH1996 σε φυσιολογικά κύτταρα και σε περισσότερες από 70 (καρκινικές) κυτταρικές σειρές. Βρήκαν ότι το AOH1996 σκότωσε επιλεκτικά καρκινικά κύτταρα, με μέση συγκέντρωση περίπου 300 nM για 50% αναστολή ανάπτυξης.
Το AOH1996 δεν ήταν σημαντικά τοξικό για μη κακοήθη κύτταρα, ακόμη και μέχρι 10 μΜ. Προκάλεσε αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο (διακοπή φάσης G2/M ή S) και απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε μη κακοήθη κύτταρα.
Ο χρόνος ημιζωής του AOH1996 αυξήθηκε κατά περίπου 27% σε σχέση με αυτόν του AOH1160 σε από του στόματος φαρμακοκινητικές μελέτες σε ποντικούς.
Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η αντικαρκινική του δράση σε ποντίκια με ξενομοσχευμένους όγκους μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, καρκίνου του μαστού ή νευροβλαστώματος. Η φαρμακευτική αγωγή μείωσε σημαντικά το φορτίο του όγκου χωρίς να προκαλέσει σημαντική απώλεια βάρους ή θάνατο.
Περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν ότι το AOH1996 άλλαξε περισσότερες από τις μισές πρωτεΐνες που σχετίζονται με το PCNA που συνδέεται με τη χρωματίνη και αυτές οι πρωτεΐνες ήταν συστατικά μεταγραφής. Ωστόσο, μόνο δύο πρωτεΐνες, υπομονάδες της RNA πολυμεράσης II (RNAPII), συμπεριλαμβανομένης της μεγαλύτερης υπομονάδας της (RPB1), έφεραν ένα γνωστό μοτίβο σύνδεσης PCNA.
Στη συνέχεια, η ομάδα εξέφρασε εξωγενώς άγριου τύπου και μεταλλαγμένες πρωτεΐνες RPB1 με επισήμανση FLAG και πραγματοποίησε ανοσοκατακρήμνιση, σημειώνοντας ότι το AOH1996 αύξησε το δεσμευμένο στη χρωματίνη άγριου τύπου RPB1 καθώς και τη συν-καταβύθιση PCNA με τον άγριο τύπο RPB1. Αυτό υποδηλώνει ότι το AOH1996 αύξησε τη σύγκρουση μεταγραφής-αντιγραφής (TRC) και ενίσχυσε τις αλληλεπιδράσεις RPB1-PCNA.
Αυτά τα αποτελέσματα ενισχύθηκαν περαιτέρω παρουσία ενός αναστολέα πρωτεασώματος (MG132), υποδηλώνοντας ότι το AOH1996 μπορεί να προκαλέσει την πρωτεασωμική αποικοδόμηση του RPB1. Αντίθετα, η συν-κατακρήμνιση PCNA με το μεταλλαγμένο RPB1 μειώθηκε παρουσία MG132 και AOH1966, υποδηλώνοντας εξασθενημένες αλληλεπιδράσεις.
Η εξέταση των εξωγενών επιπέδων RPB1 σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων αποκάλυψε ότι το AOH1996 αποδόμησε τον άγριο τύπο RPB1 με τρόπο εξαρτώμενο από το πρωτεάσωμα αλλά όχι το μεταλλαγμένο RPB1.
Περαιτέρω, το AOH1996 προκάλεσε τον διαχωρισμό του PCNA από τις ενεργά μεταγραμμένες περιοχές αλλά όχι σε περιοχές χαμηλής ή μη μεταγραμμένης ετεροχρωματίνης. Αυτό υποδηλώνει ότι το AOH1996 πυροδότησε την κατάρρευση των πιρουνιών αντιγραφής μόνο κατά τη διάρκεια της ενεργής μεταγραφής.
Συμπεράσματα
Εν ολίγοις, η μελέτη ανέφερε δύο ανάλογα αναστολέων με βάση το AOH1160 και ο υποψήφιος κύριος, το AOH1996, ήταν πιο σταθερός μεταβολικά με χαρακτηριστικά παρόμοια με φάρμακα. Το AOH1996 βελτίωσε τις αλληλεπιδράσεις PCNA-RPB1, οδηγώντας στη συνολική υποβάθμιση του RPB1 και στην κατάρρευση των διχάλων αντιγραφής σε ενεργά μεταγραφόμενες περιοχές.
Συγκεκριμένα, αυτές οι βελτιωμένες αλληλεπιδράσεις εμποδίζουν την ανάλυση TRC, οδηγώντας σε θανατηφόρα σπασίματα διπλού κλώνου και τη διακοπή του μηχανισμού μεταγραφής από την υποβάθμιση του RPB1.
Το CaPCNA διαταράσσει τη διεπαφή PCNA-TRC στα καρκινικά κύτταρα, επιτρέποντας στο AOH1996 να ασκεί επιλεκτικά και ισχυρά αντικαρκινικά αποτελέσματα με αξιοσημείωτο προφίλ ασφάλειας.
Συνολικά, η μελέτη υπογραμμίζει τις θεραπευτικές δυνατότητες του AOH1996 και τη χρησιμότητά του στον χαρακτηρισμό του TRC σε καρκινικά κύτταρα. Δεδομένης της πολυλειτουργικότητας του, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την κατανόηση των επιπτώσεων του AOH1996 σε άλλες πτυχές του PCNA.
